本文標(biāo)題："用冰凍碎裂法檢視四膜蟲的細(xì)胞膜-細(xì)胞顯微鏡"
發(fā)布者：yiyi ------ 分類: 站內(nèi)動態(tài) ------ 人瀏覽過 -----時間：2013-3-25 10:5:21
四膜蟲的分泌物，很明顯地是以一般向量性的合成方法進(jìn)入質(zhì)內(nèi)網(wǎng)，而含有分泌物的大囊泡則由細(xì)胞內(nèi)部移向細(xì)胞膜，所以在某些部位會存有一些不再移動的成熟長囊狀泡，其內(nèi)含物呈結(jié)晶形，此囊泡稱為成熟的黏液泡（mature mucocyst）。
用冰凍碎裂法檢視四膜蟲的細(xì)胞膜時，我們在黏液泡上發(fā)現(xiàn)有由九個小顆粒，圍著一個中央顆粒做環(huán)狀排列。（直徑15nm），此一構(gòu)造我們稱為融合蕊（fusion rosette），這與卡斯提羅及卡茲提出的假定部位相當(dāng)。
草履蟲絲泡分泌時，也可找到類似的部位，幾個有關(guān)草履蟲的實驗，發(fā)現(xiàn)有些突變種缺少絲泡，或只在某些溫度下，才釋出絲泡。法國分子遺傳學(xué)中心（center of molecular genetics）的貝生（Janine Beisson）、萊佛勸（Marcelle Lefort-Tran）和我，用冰凍碎裂法觀察這些突變種，發(fā)現(xiàn)它們?nèi)鄙偃诤先铮蛉诤先锖苌佟＿@是首次對分泌顆粒遺傳基礎(chǔ)的直接觀察。我們推想融合蕊是融合的必須條件。
我們近的實驗結(jié)果，也支持上面的推論，在實驗室裏，我們采用奧斯丁（Austin）德州大學(xué)湯姆生（Guy A. Thompson）和他同事的方法，以待布卡因（Dibucanine，一種局部麻醉劑）來處理四膜蟲，發(fā)現(xiàn)待布卡因會使所有成熟的黏液泡釋出內(nèi)容物，而所有的融合蕊也會消失不見，經(jīng)幾小時甦醒后，才又有成熟黏液泡及融合蕊的出現(xiàn)。
雖然許多原生動物都有融合蕊，但排列的方式卻各不相同，這可能是分泌顆粒大小不同所致。在脊椎動物的細(xì)胞膜上較難找到類似的構(gòu)造。少數(shù)脊椎動物和無脊椎動物有此類構(gòu)造，但不知是否與融合蕊的功能相同。
發(fā)現(xiàn)四膜蟲細(xì)胞膜上的融合蕊后，我們進(jìn)一步探討成熟黏液泡的膜與細(xì)胞膜上的配對位置（matching sites），冰凍碎裂圖顯示，粘液泡前端的環(huán)帶（annulus）是由五、六排顆粒所組成，直徑為10nm，但其頂端60nm直徑大小地帶，并無顆粒存在，這可能就是融合蕊的大小。細(xì)胞質(zhì)中的黏液泡沒有環(huán)帶，故推想環(huán)帶的形成與黏液泡的成熟有關(guān)。
融合膜上顆粒的配對排列，可稱之為顆粒配對群（matching clusters of particles），這些配對群在二細(xì)胞間構(gòu)成緊密接觸的聯(lián)結(jié)縫（gap junction），穿入相鄰細(xì)胞膜的內(nèi)部，使離子與微小水溶性分子互相流通，而滲透性的改變，在許多系統(tǒng)裏都與排空作用有關(guān)。
四膜蟲黏液泡內(nèi)的結(jié)晶形物質(zhì)轉(zhuǎn)變成無形質(zhì)時，即開始融合，然后黏液泡變成長囊狀，直徑有700nm，一般認(rèn)為這是因滲透性改變，水分流入、內(nèi)容物溶解所造成的結(jié)果。隨著物質(zhì)的溶解，黏液泡擴脹，釋出內(nèi)含物，使膜破裂。但一般的電子顯微鏡照片并不能表示膜內(nèi)的確實排列情形，而只表示分泌泡膜與細(xì)胞膜結(jié)合的后結(jié)果，此時分泌泡看起來像是Ω形，將照片倒過來，就像U形了。
由冰凍碎裂法看到細(xì)胞膜的P、E面，可知分泌泡從靜止?fàn)顩r到Ω出現(xiàn)時，有關(guān)膜融合的一些細(xì)節(jié)，我們應(yīng)記住成熟黏液泡的幾何構(gòu)造，是長型、有環(huán)帶，且位于細(xì)胞膜融合蕊下方。二成對膜的融合，首先在融合蕊中央出現(xiàn)凹下的融合袋（fusion pocket），融合繼續(xù)進(jìn)行，融合蕊的大顆粒會在融合袋邊緣分離開來，使融合袋增寬加深。
若在同一裂面上看到融合袋領(lǐng)襟內(nèi)緣上有碎裂P面環(huán)帶的顆粒，即表示二個半膜上P半邊的融合已經(jīng)完成。在E面也可看到同樣結(jié)果，但因含有通往外界的孔洞，所以較為模糊不清。
成對的膜連合時，細(xì)胞膜與黏液泡膜上的裂面，有明顯的球形囊泡及環(huán)帶，融合袋破裂后其直徑不超過250nm，所以環(huán)帶很可能是用來增強環(huán)（ring）的構(gòu)造，并防止因分泌所造成的細(xì)胞膜破裂，同時環(huán)帶也是黏液泡湧回細(xì)胞內(nèi)，成為部分細(xì)胞膜的支撐點。
因為冰凍碎裂法所拍的顯微照片與生化性質(zhì)相符，我們可據(jù)此擬出融合分泌程序的分子模型，來表示融合時進(jìn)行的酵素作用，以及顆粒特殊排列的原因。因為只在融合蕊上60nm的光滑地區(qū)，及其他黏液泡膜環(huán)帶內(nèi)的光滑地區(qū)，才會發(fā)生融合，所以融合主要是涉及脂質(zhì)的變化。倫敦大學(xué)的路西（Jack A. Lucy）認(rèn)為融合常在脂質(zhì)流動性增高的雙重脂層中發(fā)生，而利用磷脂酸（phospholipase）移去脂質(zhì)的排水端，即可增高流動性。四膜蟲的顆粒環(huán)（rings of particles）可能就是受限于流動率的融合區(qū)。
我們對膜融合及囊泡分泌的起動機制了解得很少，其基本問題可能涉及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca++增多時，細(xì)胞就釋出組織胺。待布卡因就是藉提高細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca++的濃度，而造成四膜蟲黏液泡的分泌。
對排空作用的研討，還有一個更大的問題，就是融合后囊泡膜的去向。我們及其他的人都已獲得證據(jù)，知道囊泡膜會在融合后成為細(xì)胞膜的一部分。因為在四膜蟲的實驗裏，并無囊泡移至細(xì)胞質(zhì)的跡象，反而在融合部位發(fā)現(xiàn)了可能是黏液泡膜併入細(xì)胞膜的痕跡。國際衛(wèi)生研究機構(gòu)的郝哲爾（John E. Heuser）和李斯（Thomas S. Reese）發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)末稍的鍵泡若長期接受分泌的刺激，則神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜會因鍵泡膜大量的併入而顯著地增厚膨脹。
這種合併的明顯與否，視細(xì)胞種類而異。但在正常情況下，鍵泡膜并不會在融合點又發(fā)生合併現(xiàn)象，所以膜的增加并不明顯。而且由吸收聚集的膜分子，并不一定在融合時即併入細(xì)胞膜，因此融合應(yīng)視為是細(xì)胞膜的換新，只要不同時產(chǎn)生合併，膜融合似乎就是促進(jìn)細(xì)胞膜生長、分化的增進(jìn)機制。
如果將鹽加入小鴨的飲水內(nèi)，在短時間內(nèi)，它們的分泌細(xì)胞的體積就已增加百倍。耶魯大學(xué)藥學(xué)系的巴內(nèi)撤（Russell J. Barnnett）和他的同伴在高氏體內(nèi)找到一種細(xì)胞膜（Na+－K+ ATPase），后來在小囊泡及新細(xì)胞膜上也找到過。他們認(rèn)為這是因為含有酵素的囊泡，在細(xì)胞內(nèi)擴大而將膜物質(zhì)，送到細(xì)胞膜去。
精冠體分泌后也會促成膜的快速膨脹。但還沒有人知道新精冠體的外膜，有多少是由精冠囊泡轉(zhuǎn)變形成的，以及有多少是由分子庫（molecular pools）裏重新聚集而成的。在其他許多具生長特性的例子裏（如植物花粉管的形成），囊泡融合對細(xì)胞膜的建造及酵素的組成，都很重要。
四膜蟲是以二分法繁殖的單細(xì)胞生物，每個細(xì)胞週期中（大約四小時），它都必須為子細(xì)胞產(chǎn)生足夠的新細(xì)胞膜，而且這些新細(xì)胞膜必須和原細(xì)胞膜一樣（如在子午區(qū)重新形成的融合蕊等）。因為許多新細(xì)胞膜是由融合的黏液泡膜提供，因此我們認(rèn)為細(xì)胞分裂后的每一融合蕊，都表示一個融合事件，這也可說明新細(xì)胞膜的局部增長現(xiàn)象，因為藉以產(chǎn)生局部增長的子午板（meridional template）在新細(xì)胞形成時仍保留著
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